等温滴定型カロリメトリー(ITC)は生体分子相互作用の定量的研究に幅広く使われる技術です。 ITCは生体分子間で結合が起きた際に生じる発熱または吸熱をダイレクトに測定します。

ITCはただ1つの測定ですべての結合パラメータを同時に特定できる唯一の手法です。 ITCは蛍光標識、または固定化などによる結合パートナーの修飾を必要とせず、天然状態に近い環境下で結合パートナーとの親和性を測定します。

結合中の熱変化を測定することで、解離定数(KD)、結合比(n)、エンタルピー変化(∆H)およびエントロピー変化(ΔS)を正確に特定できます。 これにより分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルが得られます。 ITCは結合親和性だけでなく、分子間相互作用の根本的な機序も明らかにできます。 このように構造と機能の関係についての理解を深めることで、ヒット化合物の選定とリード化合物の最適化を、より自信を持って意思決定を下すことができます。

測定原理

等温滴定型カロリメトリーは生体分子間の反応を測定するために使われます。 この手法により、標識を使うことなく、結合親和性、結合比、溶液中の結合反応のエントロピーおよびエンタルピーを特定できます。

結合が起こると、吸熱または発熱反応がおこります。この反応は、リガンドがサンプルセルに一定間隔で滴定される間、高感度のカロリメーターで測定されます。

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どのように測定する?

サーマルコア

マイクロカロリメーターには2つのセルがあり、そのうちの一方には水が入っており、リファレンスセルとして機能し、もう一方にはサンプルが入っています。 マイクロカロリメーターはこれら2つのセルを完全に同じ温度に維持する必要があります。 熱伝導センサーは結合が起こったときにこれらセル間の温度差を検知してヒーターにフィードバックし、温度差を補償してセルを等しい温度に戻します。

測定の実行

リファレンスセルとサンプルセルを目的の測定温度に設定します。 リガンドは、正確に滴下量をコントロールできるインジェクション装置に設置したシリンジに充填します。 目的のタンパク質が入ったサンプルセルにインジェクション装置を挿入します。 少量のリガンドを一定間隔でタンパク質溶液に滴下します。 リガンドがタンパク質に結合すると、数百万分の1℃の変化が起こり、これを検知して測定します。

滴下が始まると、マイクロカロリメーターは結合反応が平衡状態に達するまでに生じた全ての熱量変化を測定します。  測定した熱量は結合量と比例します。

結果とデータ解析

下記は発熱反応の例です。サンプルセルの温度がリファレンスセルよりも高くなり、サンプルセルの温度を下げるフィードバックをかけたため、シグナルが下側のピークとして現れます。 2つのセルの温度が等しくなると、シグナルがベースラインに戻ります。 2滴下目のリガンドがサンプルセルに添加されると、マイクロカロリメーターが微小な熱量変化を検出し、再度温度差がゼロになるように補償します。 リガンドとタンパク質の間のモル比はリガンドを添加していくにつれて徐々に増加します。 タンパク質のリガンド飽和度が高まると、リガンドの結合が減り、熱量が減少し始め、最終的にサンプルセルにはタンパク質に対して余分なリガンドが含まれ、反応が飽和状態に近づきます。

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最終的に各ピークが積分され、リガンド対タンパク質のモル比に対してプロットされます。 その結果得られる等温滴定曲線は、親和性(KD)が得られる結合モデルでフィッティングされます。 等温滴定曲線の中点にあたるモル比により、結合比が求められます。 下記のグラフは1対1の結合反応の例です。

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エンタルピー変化(ΔH)も等温滴定曲線から直接導き出されます。結合したリガンド1Mあたりに対して放出される熱量を示します。 つまり、1回のITC測定で結合反応に関する多くの情報が得られ、これらは相互作用の本質の理解と、熱力学的な駆動力の探索に寄与します。

ITCは創薬および薬剤開発で、以下のような目的で広く使われています。

  • 結合親和性の定量化
  • 候補薬の選定と最適化
  • サーモダイナミクスと活性濃度の測定
  • 作用機序の特性評価
  • 低分子創薬における対象結合ターゲットの確認
  • 結合の特異性と結合比の把握
  • hit-to-leadにおけるIC50およびEC50のバリデーション
  • 酵素反応速度の測定

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