ほとんどのバイオ医薬品は、タンパク質またはタンパク質誘導体であり、現在市場に出回っている、または開発中のバイオ医薬品のうち、単一で最大のクラスはモノクローナル抗体（mAb）です。 抗体の特異的結合特性のおかげで、バイオ医薬品業界は、抗体を利用して疾患を制御または予防するために医薬品に適した標的分子の活性を調節、できます。
従来の低分子医薬品とバイオ医薬品の重要な相違点は、後者の場合、液体の形態で処理・送達する必要があることです。 タンパク質は溶液中では不安定であることが知られているため、これらのバイオ医薬品分子を製造し、劣化させずに溶液中で長期間保存できるアプローチを開発する必要があります。 その点において、バイオ医薬品の開発および製造においてタンパク質安定性評価は非常に重要であることが証明されています。
間違いなく溶液中のタンパク質の寿命または保管期間を評価するために、実時間安定性評価が必要とされています。 しかしながら、これには時間がかかることが多いため、安定したバイオ医薬品製剤およびプロセス条件を開発できる学習プロセスを加速化するために、迅速で予測的な手法が確立されています。
これらの予測アプローチの中で最も一般的なものは、タンパク質の物理的特性を温度変化に応じて監視する熱変性（アンフォルディング）法です。 これらのデータを用いると、タンパク質が構造変化を起こす温度を判定し、比較試験に利用することができます。 構造変化を誘発するために高い温度を必要とする分子は、長い保管期間を有しているか、安定していると推定されます。 ただし、重要な例外がいくつかあります。これについては、本書の後半で説明します。
同一の緩衝液中の異なる医薬品候補を対象に、アンフォールディングまたは熱安定性プロファイルを得て、所定の条件下で潜在的なバイオ医薬品の本質的な安定性を比較することができます。 この応用を「候補選択」と言います。
一連の緩衝液および共溶質中の任意の候補分子を対象に、熱安定性プロファイルを生成することができます。これは、安定/不安定化条件を確認するのに役立ちます。 典型的な製剤添加物または賦形剤には、アミノ酸、糖、ポリオール、塩、界面活性剤などがあります。これらの物質が評価に干渉しないように注意する必要があります。 この種の試験は通常、予備処方／処方およびプロセス開発グループによって実施されます。 後者の目的は、安定したローディングおよび溶出緩衝液を識別することで、バイオ医薬品の収率を最大にする精製戦略を判別し、クロマトグラフィープロセスおよびウイルス不活性化工程の最適化を実現することです。
示差走査型カロリメトリー（DSC）など、これらの解析技術のうちより定量的なものは、バイオシミラリティおよび同等性の調査にも使用されます。
先に述べたように、構造変化を引き起こすために高い温度を必要とするように見える分子は、長い保管期間を有すると推定されます。 ただし、これらの変化を監視するために選択した手法が、特定の構造事象または化学的不活性化プロセスを「認識できない」場合、この「経験則」は誤解を招く可能性があります。 これは、次のタンパク質安定性評価プラットフォームを購入する際に注意深い検討が必要な理由の1つです。
タンパク質の安定性を測定するための技術が市場にはいくつか出回っています。 多くのメーカーは、示差走査型カロリメトリー（DSC）によって得られた結果と比較することにより、これらの装置が生成するデータの品質を実証しています。 DSCは、メーカーの技術を測定する基準となるものです。これは、生物物理学的なコミュニティがDSCデータに下している評価の高さを示しています。 このため、DSCはしばしば「最高水準」と呼ばれています。
DSCの有用性についてある顧客は次のように力説しています。
「DSCは、現在利用可能なすべての生物物理学的手法の中で、おそらく最も強力で情報量が多く適切なものと考えられます」
Sorina Morar-Mitrica（Ph.D - GlaxoSmithKline）「BioProcessing Summit（2012）」での発言。
これらの代替技術が優れたデータを生み出すという例は枚挙にいとまがありませんが、あまり役立たなかった例もたくさんあることも認めざるを得ません。 うまくいかなかった例が公表されることはめったにないのも確かです。
どのベンダーも独自の専門用語を使用し、他社とは異なる方法でそれぞれの装置および仕様を提示しています。 しかしながら、タンパク質の安定性測定に使用できる装置に関するどのような検討事項も、まずは特定用途の必要条件を把握し、製品の仕様と機能がそれらにどのような影響を与えるかを理解することから始めなければなりません。
タンパク質安定性のための技術で、カロリメトリー以外の技術を提供するほとんどのベンダーは、DSCを基準に自社の製品を直接位置付けています。 中には、1回の試料消費量が少ないという利点を備えている製品もありますが、情報の内容と再現性を犠牲にしています。 生成されたデータが誤解を招き、意思決定に悪影響を与える可能性がある場合、試料を節約できたとしても利点とは言えません。 あいまいなタンパク質安定性データのせいで開発プロジェクトの大部分をやり直さなければならなくなった場合、コストが非常にかさみます。
1.すべてのタンパク質/バイオ医薬品候補の安定性を評価するために装置を使用できるようにしたいと考えていますか？
DSCは、存在するトリプトファン残基の数や位置にかかわらず、すべてのタンパク質の解析に適用可能です。
自家蛍光を測定する他の技術は、タンパク質安定性の間接的な評価でしかありません。 そこで実際に測定されるのは、タンパク質のアンフォールディングの進行に従ったトリプトファン残基の環境の極性変化です。
この手法には、いくつかの問題があります。 この特定のアミノ酸残基の環境の変化は、分子のアンフォールディング全体を描写する必要があります。 つまり、トリプトファン残基は、タンパク質のコアに埋め込まれ、マルチドメインタンパク質のすべてのドメインにも存在している必要があります。 実際には、そのようなことは起こりそうもありません。 トリプトファン残基を含まないサブドメインの構造的安定性は評価されないため、処方または候補の選択が不正確になるおそれがあり、開発パイプラインの次の部門に影響を及ぼします。 いくつかのタンパク質はトリプトファン残基も含まないため、自家蛍光法を用いて分析することがまったくできません。
図1：生物製剤候補のDSCサーモグラム。 これらのデータは、異なる緩衝液中の抗体の熱アンフォールディングを示します。 プロファイルは、抗体のCH2、CH3、およびFab領域のアンフォールディングを表す明確なショルダーを示しています。 より高いTMおよびより低いT1/2のために、下部パネルで用いた処方条件を使用するために選択しました。
2.マルチドメインタンパク質中の個々のドメインのすべての安定性を特性評価したいと考えていますか？
DSCの再現性が高く、タンパク質全体の構造変化を監視できるため、個々のサブドメインの安定性を明確に測定するために使用できます。 サブドメインに関する情報を含むタンパク質安定性プロファイルを生成する分光法の例はありますが、これらのデータを提供できない場合や、特定の構造変化を認識できない場合もしばしばあります。 これは、トリプトファン残基が蛍光検出に理想的な方法でタンパク質全体に分布していないためです。トリプトファン残基を埋め込むドメインも、埋め込まないドメインもあります。 これは、装置が最初の転移を認識できなくなり、タンパク質の測定に使用された技術では識別できない構造変化がタンパク質に生じたため、候補または製剤緩衝液を誤って選択してしまう場合に特に重要です。 DSCは、タンパク質の安定性を測定するための包括的でグローバルな高分解能技術であり、こうした問題を抱えていません。
図2：自家蛍光検出によって観察される抗体の熱アンフォールディング。 プロファイルには急な転移がないため、TMの判別には最適とは言えませんでした。
抗体のサブドメイン安定性を監視するためにDSCを使用するもう1つの利点は、一般的にFab結合ドメインのサイズは、CH2ドメインおよびCH3ドメインのサイズよりも大きく、同定がより容易になることです。 大部分の分光法のための信号の振幅は、ドメイン特有ではありません。したがって、どのドメインが安定しているか不安定かを理解することは、まったく些細なことではありません。 これは、生物製剤のどの部分が影響を受けているのかを理解することが不可欠となるタンパク質工学プロジェクトおよび候補選択にとって特に重要です。
3. データには、結果に影響を与える可能性のある実験のアーティファクトを含まなくしたいと考えていますか？
試料消費量の少ない多くの方法は、タンパク質の安定性の間接的測定として蛍光法を使用します。 以前に説明した問題に加え、蛍光法にはある種のアーティファクト（急冷、内部濾過、凝集、光散乱など）があります。これらは通常、試料濃度に応じて変化します。 これは、2つの重要な結果をもたらします。 第一に、異なる共溶質がすべて同じ濃度であることを保証するのは困難で時間がかかるため、異なる日および異なるラボでデータを比較するときに再現性のあるデータを得ることは非常に難しいことです。 第二に、これらのアーティファクトがアンフォールディング時のカーブの形状に影響を与えることです。これにより、解析は実行のたびに異なり、非常に主観的なものになり、正しく解釈するために多くの専門知識が必要になります。
一部の分光タンパク質安定性評価は、タンパク質の安定性を監視するために染料を使用する必要があります。 これらの評価は、自家蛍光と同じ問題を抱えているだけでなく、染料がタンパク質自体の安定性に影響を与えることも、緩衝液の成分が染料とタンパク質との相互作用の程度に影響を及ぼすこともあります。 この結果、安定性プロファイルに反映されるのは、緩衝液成分からの干渉によってさらに複雑になったタンパク質と染料の相互作用です。これは、タンパク質の安定性自体とはほとんど無関係です。 これはまた、潜在的な医薬品標的と結合する低分子をスクリーニングするための間接的方法として安定性プロファイルが使用される用途にも当てはまります。
DSCがタンパク質全体の安定性を測定する第1の原則的手法-真にグローバルな手法-であるという事実は、上記のような制限を受けないことを意味します。
4.再現可能なデータが必要ですか？
DSCは、その再現性の高いデータのために、「最高水準」のタンパク質安定性評価と呼ばれることがしばしばあります。 このため、DSCはバイオシミラリティおよび生物学的同等性試験に使用されています。 DSCは、最近バイオ医薬品であるRemsima（Remicadeのバイオシミラー）の承認申請が認可される上で中心的な役割を担った技術です。 もう1つの例は、酸化したバイオ医薬品を同定する上でDSCが最良の技術であると発見した、当時Amgenに所属していたあるグループの業績です。 この応用が成功した理由は、DSCデータの高い再現性、およびDSCはマルチドメインタンパク質の高次構造における微妙な変化さえ検出できるという事実でした。
DSCはまた、さまざまな形態の癌患者を特定するための診断ツールとしても、その有用性が研究されています。 明らかに、DSCの再現性はこの用途の鍵となります。 以下はこの研究を行ったチームの主任科学者の発言で、マルバーンのMicroCal VP-Capillary DSCによるDSCデータの高い再現性を強調しています。
「大規模な試料セットで無人の試験を実施する場合に特に適しており、人的/偶発的なミスを最小限に抑えることができます」
「優れた走査再現性と高い感度で、試料の使用量を減らすことができます」
「制御ソフトウェアで簡単にプログラムできます」
「定期的なクリーニング／制御走査をプログラミングすることで、保守管理や機能の維持が簡単になります」
Adrian Velazquez-Campoy（サラゴサ大学BIFI研究所、スペイン）
5.さまざまな緩衝液または共溶質でバイオ医薬品の安定性を測定したいと考えていますか？
技術によっては、互換性のある緩衝液や共溶質に対する非常に特殊な要件を持つものがあります。 円偏光二色性は、この制約の良い例です。なぜなら、処方研究で使用される緩衝液など、一部の緩衝液は、タンパク質と同じ波長で光を吸収し、信号の飽和を引き起こすためです。 さらに、製剤緩衝液の共通成分である界面活性剤は、使用量がごくわずかな場合でも、大部分の蛍光ベースの技術と両立しません。
DSCは非分光法であり、こうした問題の影響を受けません。
6.高い熱安定性を持つタンパク質を特性評価する必要がありますか？
DSCは、タンパク質の 広範囲の熱安定性を測定するように特別に設計されており、周囲温度より低い場合も高温環境の場合も機能するように設計されています。 一方、分光法は通常、20℃未満または90℃以上では使用できません。 熱安定性の低いタンパク質の熱変性の開始は、しばしば周囲温度より低い環境下で起こり、分光法ではたいてい見逃してしまいます。 一方、多くのタンパク質は90℃未満のTMまたは中点の温度転移を示しますが、終点を正確に測定できるように、通常は20℃高い温度が必要です。
このため、タンパク質のいずれかでTMが70°C前後の場合、DSCを使用する必要があります。
7.簡単に解析できるデータが必要ですか？
マルバーンのMicroCal VP-Capillary DSCは、自動解析ソフトウェアを使用し、主観を排除して、専門知識の必要性を最低限に抑えます。 さまざまな競合技術の結果は、非常に主観的で解析が困難です。 これは、抗体などのマルチドメインタンパク質を解析する場合に特に明白です。
「高いスループットは、解析ソフトウェアでサポートされており、ソフトウェアは使いやすく、手動による計算は不要になるため、時間を節約できます。 この時間の節約で、ワークフローが実際に改善されました」
Katherine Bowers（Fujifilm Diosynth Biotechnologies）
8.タンパク質の安定性の微妙な変化を検出したいと考えていますか？
DSCは、タンパク質構造のすべてのレベル（1次、2次、3次、4次）で変化を検出することができ、きわめて高い再現性を備えています。 つまり、DSCはTM、ひいては高次構造（HOS）のごくわずかな変化でさえも検出します。
最近の例を挙げると、マルチドメインタンパク質のDSCサーモグラムが、さまざまな分光法に比べ、望ましくない低レベル（<5％）の酸化バイオ医薬品を検出する最良の手法であることがわかりました（Arthurら、（2015）J Pharm Sci、Vol 104、1548–1554）。
9.適切な装置メーカーを選ぶには？
品質に確実に投資できるようにするには、お客様が本当に信頼できる装置メーカーまたはベンダーを見つけることが重要です。
DSC装置は、公表できるまたは意思決定のための結果を生み出すために、高品質の製造と信頼のおける最先端の技術を有する企業でなければなりません。
これらの技術を最前線で開発し、最適化してきた歴史を持つメーカーを選ぶことをお勧めします。 このような企業は、装置の品質にばらつきがなく、通常革新的な技術やアプリケーションを生み出す先駆者となります。 そうした企業は専門知識、経験、サポートリソースを備えており、優れた装置を製造するだけでなく、ご購入後のサポートも充実している可能性が高いと思われます。
10.アフターサービスおよびサポートはどうでしょうか？
装置の購入はベンダー/メーカーとの長い関係の始まりに過ぎないため、満足できるサービスと販売後のサポートを提供する企業からシステムを購入することが重要です。
電話、来訪、メールなどによるサポートや、持続的トレーニング、現地修理点検、さらにエキスパートレベルサポートを提供できる企業をお勧めします。 装置を購入する前に、どのようなサポートが用意されているかを尋ねてみましょう。新しい装置をラボに設置した後で、質の良い丁寧なサポートを期待できるかどうかを把握できます。
用途/要件 | MicroCal DSC | 円偏光二色性 | 自家蛍光 | 外在蛍光 |
すべてのタンパク質で共通 | あり | あり | いいえ | いいえ |
タンパク質構造のすべてのレベルに感受性あり | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
フォールドされた量に正比例する定量的な読み出し | あり | あり | いいえ | いいえ |
グローバル、高分解能のタンパク質安定性評価 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
タンパク質安定性の複数の測定基準 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
アンフォールディングプロファイルの指標化特性 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
光学的なアーティファクトなし | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
高い再現性 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
染料、ラベル、化学添加物は不要 | あり | あり | あり | いいえ |
緩衝液と共溶質の干渉なし | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
70°Cを超えるTMを測定 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
最高水準のTM測定 | あり | いいえ | いいえ | いいえ |
上記の表は、DSCがなぜバイオ医薬品業界に普及しているのか、「最高水準」のタンパク質安定性測定と考えられているのかを明確に示しています。 バイオ医薬品開発パイプラインの主な用途の技術の有用性をランク付けするよう求められた際に、業界の多くの専門家が回答した内容を記載した最近の論文でも、この主張は支持されています（Gabrielson and Weiss IV (2015)、Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245）。 用途は、候補選択および処方開発から同等性およびバイオシミラリティにまで及んでいます。
DSCは、バイオ医薬品の安定性を評価する手法として明らかに最適なものです。
一部の非分光法はDSCよりも試料消費量を抑えられますが、それは単にこの用途には不適切であることを示している場合がしばしばあります。これは、染料の干渉、散乱、内部濾過、劣悪な信号、信号の消失、不十分なサブドメイン構造情報などの固有の弱点に起因するものです。
これらの欠陥や不適合の多くは、プロジェクトの開発し直しやバイオ医薬品開発の頓挫をもたらすきわめて費用のかさむ不適切な意思決定に陥る可能性があります。
マルバーンのMicroCal DSCは、どのような緩衝液にあるどのようなタンパク質に対しても、再現可能でアーティファクトのない、最高水準を提供いたします。
