샘플에 가장 적합한 GPC/SEC 컬럼 세트 구성
GPC/SEC(예: OMNISEC)로 작업해 본 적이 있다면 모든 분석이 컬럼 세트 구성(column set)에 의존한다는 것을 알고 계실 것입니다. 그리고 귀하의 응용 분야에 적합한 컬럼을 선택하는 것이 때로는 어려울 수 있습니다. 때로는 다른 유형의 샘플에 대해 완전히 새로운 컬럼 세트 구성이 필요할 수도 있습니다.
샘플에 가장 적합한 컬럼 세트를 선택할 때 고려해야 할 사항이 여러 가지 있습니다. 분자 크기/무게 범위, 샘플을 용해하는 데 사용해야 하는 이동상과 컬럼의 호환성, 샘플에 있는 작용기와 컬럼의 고정상의 호환성 등을 고려해야 합니다. 여러 개의 열을 사용하는 경우 서로 보완하는지, 연결해야 하는 순서는 무엇인지 고려해야 합니다.
이 게시물에서는 컬럼에 대한 일반적인 정보를 제공하고 샘플에 적합한 컬럼 세트를 만드는 방법에 대한 통찰력을 제공하겠습니다. 여기에 있는 정보는 주로 분자 크기/중량 범위 관점에서 최상의 컬럼 세트를 선택하는 것과 관련됩니다. 다양한 이동상 분석에 사용할 수 있는 컬럼에 대한 정보는 여기에 링크된 게시물과 웹 세미나를 참조하세요.
컬럼 세트에서는 어떤 일이 발생할까요?
GPC/SEC 컬럼 세트 내 분리가 어떻게 작동하는지에 대한 간략한 개요부터 시작하겠습니다. 위 이미지에서 볼 수 있듯이 크기가 다른 두 샘플의 용해된 혼합물이 컬럼에 도입됩니다. 시간의 흐름에 따라 두 개의 시료 분획과 용해 용매가 컬럼을 통해 서로 다른 속도로 이동합니다. 가장 큰 크기의 샘플이 먼저 용출되고(Population 2), 더 작은 크기의 샘플(Population 1)이 그 뒤를 따르며, 용해 용매가 마지막으로 용출됩니다.
분리(separation)는 시료의 분자량이 아닌 분자 크기를 기반으로 한다는 점을 이해하는 것이 중요합니다!
이러한 분리는 컬럼의 고정상이 기공(pore)이 있는 겔 입자로 구성되어 있기 때문에 발생합니다. 이러한 구멍은 샘플 분자가 컬럼을 통과할 때 구멍 안으로 확산될 만큼 충분히 큽니다. 작은 분자는 기공으로 더 쉽게 확산되므로 중간 및 큰 크기의 분자보다 기공에서 더 많은 시간을 보냅니다. 가장 큰 분자는 기공으로 쉽게 확산되지 않으므로 컬럼을 통과하는 경로가 더 간단하고 더 빠릅니다.
GPC/SEC를 사용하면 분리는 분자 크기를 기준으로 이루어지며, 큰 분자가 먼저 용출되고 그 다음 중간 분자와 작은 분자가 용출됩니다. 이 과정은 아래의 애니메이션 묘사를 참고 부탁드립니다. 큰 삼각형이 기공으로 확산되는 데 많은 시간을 소비하지 않고 먼저 용출되고, 중간 사각형이 뒤따르고, 마지막으로 작은 원이 기공으로 쉽게 이동할 수 있습니다.
혼합층 및 단일 기공 크기 컬럼
이 두 가지 유형의 컬럼의 차이점은 이 게시물에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 요약하자면, 혼합층 컬럼에는 입자와 기공 크기가 혼합된 고정상 겔(stationary phase gel)이 포함되어 있어 넓은 분자 크기/무게 범위에 걸쳐 분리능(resolution)을 제공합니다. 단일 기공 크기 컬럼에는 균질한 고정상 겔이 포함되어 있어 상대적으로 제한된 분자 크기/중량 범위에 걸쳐 탁월한 분리능을 제공합니다.
컬럼을 결합하여 컬럼 세트를 만드는 방법
샘플에 최적화된 컬럼 세트를 생성하려면 두 개 이상의 컬럼을 결합해야 할 것입니다. (그러나 하나의 컬럼이 샘플에 충분한 분해능을 제공하고 필요한 전부라면 컬럼 결합이 필요하지 않을테지요.) 이렇게 하면 시간과 이동상이 절약됩니다. 이는 종종 단백질 샘플의 경우입니다. 단백질의 분자량은 넓은 범위를 포괄하지만 접힌 구조로 인해 단백질 샘플의 크기 범위는 폴리머의 크기 범위보다 좁습니다.
컬럼을 결합하여 세트를 만들 때 취하는 세 가지 일반적인 접근 방식이 있습니다. 저희는 이 방식을 제안 드릴 뿐, 이 방법이 전부는 아니라는 점을 참고 부탁 드립니다.
2개의 혼합층 컬럼: 가장 일반적인 범용 컬럼 세트이며, 유기 컬럼, 수성 컬럼, 특수 컬럼까지 포함합니다. 명확히 하자면, 동일한 혼합 bed columns 2개를 사용하겠습니다. 예를 들어, 다당류 배치를 분석할 때 수용성 분석용 혼합층 컬럼인 A6000M 컬럼 2개를 자주 사용합니다. 이와 같이 2개의 혼합층 컬럼을 사용하면 분자 크기/무게 범위를 최대화하고, 실행 시간을 약 45분 이하로 유지하는 최적의 지점에 도달하는 경향이 있습니다.
고/저 MW 컬럼과 혼합층 컬럼 결합: 응집체 또는 올리고머(oligomers)와 같이 특히 고분자 크기/무게가 높거나 낮은 종이 존재하는 시료의 경우 고/저 단일 기공 크기 컬럼을 추가하는 것을 선호합니다. 단일 혼합층 기둥으로. 고/저분자량 단일 기공 크기 컬럼은 분자 크기 연속체의 극단 중 하나에서 샘플의 특정 특징에 대한 충분한 분리능을 보장하는 반면, 혼합층 컬럼은 나머지 샘플 물질을 설명해줍니다. 샘플과 용매 피크 사이의 분리능을 향상시키고자 한다면, 혼합층 컬럼에 저분자량 컬럼을 추가하면 됩니다.
여러 개의 단일 기공 크기 컬럼 결합: 이 전략은 혼합층 컬럼이 제공하는 전체 분자 크기/중량 범위 분리능이 필요하지 않다는 것을 알고 있는 경우에 적합합니다. 이러한 유형의 컬럼 세트는 QC와 같은 유사한 샘플을 모니터링하는 환경에서 유리할 수 있습니다. 장점은 시료와 관련된 분자 크기/무게에서 최대 분해능을 얻을 수 있다는 것입니다. T5000 + T3000 + T1000과 같이 2개 이상의 단일 기공 크기 컬럼을 결합하여 넓은 분자 크기/무게 범위를 포괄할 수도 있습니다. 이 예에서는 분석 시간이 연장되지만 향상된 분해능을 제공합니다.
단일 기공 크기 컬럼을 결합할 때, 컬럼이 한 컬럼 이상 떨어져 있지 않은지 확인하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 해상도 범위에 차이가 발생하는 것을 방지할 수 있습니다. 3개의 단일 기공 크기 컬럼을 사용한 위의 예를 다시 살펴보려면 단순히 T5000 + T1000을 결합하는 것은 권장하지 않습니다. 분해능 범위 사이의 차이로 인해 아래 표시된 것과 같은 용출 프로필이 생성될 수 있으며, 이는 샘플이 아닌 크로마토그래피의 결과로 데이터에 이상한 피크 모양과 아티팩트(artifacts)가 발생할 수 있습니다.
컬럼의 순서
많은 분들이 ‘컬럼을 결합할 때 어떤 순서로 연결해야 하는지’ 궁금해합니다.
저희가 권장 드리는 합리적인 순서는 가장 높은 분자 크기/무게 컬럼으로 시작한 다음 가장 낮은 분자 크기/무게 컬럼으로 내려가는 것입니다. 이렇게 하면 전체 시료 혼합물이 처음 컬럼 세트에 도입될 때 가장 큰 분자가 분리되기 시작할 수 있습니다. 컬럼이 낮은 순서로 배열된 경우, 가장 큰 분자가 저분자 크기/무게 컬럼을 통해 압착되어야 하며 잠재적으로 더 작은 분자가 기공으로 확산되는 것을 방해할 수 있습니다.
그렇기 때문에 위에서 사용한 예에서는 T5000 + T3000 + T1000 열을 사용했습니다. 단일 기공 크기 컬럼을 혼합층 컬럼에 결합할 때, 혼합층 컬럼 앞에 고분자 크기/무게 단일 기공 크기 컬럼을 추가하고, 혼합층 컬럼 뒤에 저분자 크기/무게 단일 기공 크기 컬럼을 추가합니다.